COMPOSICIÓN QUÍMICA, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL PROVENIENTE DE LA HOJAS DE Piper pubinervulum C. DC PIPERACEAE
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COMPOSICIÓN QUÍMICA, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL PROVENIENTE DE LA HOJAS DE Piper pubinervulum C. DC PIPERACEAE

CHEMICAL COMPOSITION, ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THE ESSENTIAL OIL FROM LEAVES OF Piper pubinervulum C. DC PIPERACEAE

Paco F. Noriega 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Tatiana Mosquera 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Juan Abad 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Diana Cabezas 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Sebastián Piedra 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Ivonne Coronel 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
María E. Maldonado 1
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Anna Bardiserotto 2
Università degli studi di Ferrara, Italia
Silvia Vertuani 2
Università degli studi di Ferrara , Italia
Stefano Manfredini 2
Università degli studi di Ferrara, Italia

COMPOSICIÓN QUÍMICA, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL PROVENIENTE DE LA HOJAS DE Piper pubinervulum C. DC PIPERACEAE

LA GRANJA. Revista de Ciencias de la Vida, vol. 24, núm. 2, 2016

Universidad Politécnica Salesiana

Recepción: 14 Marzo 2016

Aprobación: 12 Octubre 2016

Resumen: Piper pubinervulum C. DC., es una planta medicinal utilizada por los indígenas amazónicos del sur del Ecuador, las hojas poseen características aromáticas. El objetivo de la presente investigación es la de extraer y analizar las propiedades químicas y de actividad biológica del aceite esencial proveniente de las hojas.El estudio de composición química a través de GC-EM y RMN 1H arrojó la detección de 44 constituyentes dentro de los cuales cariofileno, isoeugenol-metil éter, asarona y el nerolidol fueron los mayoritarios. La Actividad antioxidante del aceite fue evaluada por los métodos DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ABTS (2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) y la fotoquimioluminiscencia (PCL). Adicionalmente se realizaron estudios de actividad em- pleando (HP)TLC-DPPH bioautográficos. La actividad antimicrobiana fue evaluada por el método de difusión de disco en dos bacterias Gram+, dos bacterias Gram- y dos levaduras. Los resultados más interesantes se producen con las dos levaduras Candida tropicalis (MIC 0,77 mg/ml) y Candida albicans (MIC 0,33mg/ml) donde la actividad fue similar al aceite esencial de Thymus vulgaris el estándar natural de referencia. Los buenos resultados con respecto a la actividad antifúngica nos llevan a concluir que el aceite esencial podría ser usado con esta finalidad.

Palabras clave: GC/EM, DPPH and ABTS test, MIC, bioautobiografía.

Abstract: Piper puvinervulum C. DC. is a medicinal plant used by Amazon Indians in southern Ecuador, the leaves possess aromatic characteristics. The objective of this research is to extract and analyze the chemical properties and biological activity of the essential oil from the leaves. The study of the chemical composition based on analysis GC-MS and 1H RMN data resulted in the identification of 44 compounds including the main components: -caryophyllene (1), isoeugenol methyl ether (2), asarona (3), and nerolidol (4). The antioxidant potential of the oils was assessed with the DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ABTS (2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diam- monium salt), Photochemiluminescence and bioautographic HPTLC-DPPH methods. The antimicrobial activity was evaluated by means of disc diffusion method while the antimicrobial effect was evaluated in two Gram+ bacteria, two Gram- bacteria, and two yeasts. The essential oil was found effective against Candida tropicalis (MIC 0,77 mg/ml) and Candida albicans (MIC 0,33mg/ml) yeasts in a manner similar to the reference essential oil of Thymus vulgaris. The positive results in terms of antifungal activity suggest that the essential oil could be used for this purpose.

Keywords: GC/MS, DPPH and ABTS test, bioautography MIC.

Forma sugerida de citar:

Noriega, P., T. Mosquera, J. Abad, D. Cabezas, S. Piedra, I. Coronel, M. E. Maldonado, A. Bardiserotto, S. Vertuani y S. Manfredini. 2016. Composición química, actividad antioxidan- te y antimicrobiana del aceite esencial proveniente de la hojas de Piper pubinervulum C. DC Piperaceae. La Granja: Revista de Ciencias de la Vida. Vol. 24(2):111-123. ISSN: 1390-3799.

1 Introducción

La Familia Piperaceae cuenta con unas 1919 especies distribuidas en las zonas tropicales. En la América tropical se tienen alrededor de 700 especies (Jaramillo y Manos, 2001). En Ecuador se tienen 4 géneros y 441 especies, de las cuales 134 son endémicas (Jørgensen y León-Yánez, 1999).

P. pubinervulum está reducidamente distribuida en la cordillera oriental en Morona Santiago y la región del noreste de Perú, en la reserva Santiago-Comaina (Macbride, 1960). Es un arbusto perenne, con tallo leñoso de nudos engrosados y de consistencia herbácea frondosa, que alcanza los 3 m de altura; posee grandes hojas acorazonadas, lanceoladas de olor penetrante, levemente pubescente y flores blancas rudimentarias; con espigas opuestas a las hojas se asemejan a espigas como cordoncillos que producen un fruto de pulpa pequeña (Plant Caterpillar Parasitoid Interactions, 2013).

Aunque no se encuentra información etnofarmacológica sobre la planta, los principales usos populares son antigastrálgico, antireumático, analgésico y para contrarrestar las mordeduras de serpientes.

Dentro de los estudios de composición química y actividad biológica de especies de Piperaceae de origen amazónico, se destacan aquellos realizados en Piper aduncum (Oliveira et al., 2013; Guerrini et al., 2009), en el primera investigación se destaca la presencia de 1,8 cineol y en la segunda de dillapiol, Piper hispidinervum (Sauter et al., 2012) en donde el componente principal es el safrol, Piper auritum (Diego, 2012) cuya molécula mayoritaria es el safrol y se resalta su actividad antifúngica, en Piper holtonii (Diego, 2012) la molécula más abundante es el apiol y se observa una muy buena actividad antifúngica, y Piper divaricatum (Barbosa et al., 2012) en donde se observa un elevado contenido de safrol y una buena actividad antimicrobiana, entre los estudios más importantes.

El presente estudio centra su investigación en el análisis del aceite esencial proveniente de las hojas de P. pubinervulum debido a que esta parte de la planta es la usada por las comunidades indígenas y a que la misma al igual que otras variedades de piperáceas posee una aromaticidad característica. Para la especie en estudio no se encuentra información de composición química de su aceite esencial así como de actividad biológica, por lo que esta primera investigación tiene una importancia fundamental en la valoración de este recurso biológico de la amazonía ecuatoriana.

2 Materiales y métodos

2.1 Material vegetal

Las hojas de P. pubinervulum fueron recolectadas en la estación biológica Shakaim de la localidad amazónica de Huamboya, situada a 347 km al sureste de Quito, en la provincia de Morona Santiago. En las coordenadas, latitud 0148’0.26”S; longitud 7814’60"W, y a una altitud de 1.080 m.s.n.m. El reconocimiento botánico estuvo a cargo del Herbario del Instituto de Investigación y Posgrado de la Universidad Central del Ecuador.

El aceite esencial se obtuvo mediante destilación en corriente de vapor de las hojas frescas en un destilador de 250 L de capacidad. El rendimiento del aceite [% (p/p)] fue calculado considerando el peso del material vegetal; fue determinada la densidad empleando el método del picnómetro (Durst y Gokel, 1985).

2.2 Análisis GC/EM

El aceite esencial fue analizado por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas. Se usó un gas cromatógrafo Varian 3900, equipado con una columna Factor four VF-5ms (5%-fenil-95% dimetil polixiloxano) de 30 m de largo, con un diámetro interno de 0,25 mm y una película de 0,25 µm, directamente acoplada a un espectrómetro de masas Varian 2100. El gas portador fue helio con un flujo de 1 mL/min, y un split ratio de 1:50. El análisis inicia a los 45C y llega a los 100C a una velocidadde 1C por minuto, posteriormente se eleva auna temperatura de 250C a una velocidad de 5C, manteniéndose a esa temperatura por 15 minutos, el tiempo final de análisis fue de 90 minutos.

Las condiciones del espectrómetro de masas fueron: energía de ionización, 70 eV; corriente de emisión, 10µAmp; velocidad de barrido, 1 scan/min; rango de masa, 35-400 Da; temperatura de la trampa 220C; temperatura de línea de transferencia, 260C.

2.3 Determinación de la composición del aceite esencial

La identificación de los compuestos fue efectuada por comparación de los espectros producidos por ionización electrónica con la base de datos electrónica NIST 2001.

Adicionalmente se calcularon los índices de retención experimentales que fueron determinados en relación a los tiempos de retención de una serie de n-alcanos (C10-C30) estándar Sigma Aldrich. Fueron analizados los índices de retención teóricos comparados con bases de datos de espectros en moléculas aromáticas (Adams, 2007; Adams, 2012).

2.4 Espectroscopia RNM 1H

El aceite entero fue analizado por el método RNM1H, con la finalidad de identificar los compuestos mayoritarios con base en datos descritos (Rossi et al., 2011; Noriega et al., 2014).

El espectro RNM 1H fue obtenido en un espectrofotómetro Varian VNMRS-400 que opera a 399.97MHz a una temperatura de 298K. El aceite esencial a una concentración de 24mg/ml se disolvió en cloroformo deuterado en tubos RMN de 5mm de diámetro, el solvente usado para la calibración espectral fue cloroformo deuterado (1H7,26 ppm). El espectro 1H se corrió utilizando una secuencia de pulso standar “s2pul”, con 45.0 gradosde impulso, y 3 segundos como tiempo de adquisición,con 8 repeticiones, 6400Hz de ancho espectral, 0,33Hz Resolución Fid. Las señales del espectro fueron comparadas con estándares puros de cariofileno, nerolidol y asarona, presentes en diversas basesde datos (Predict 1H Proton NMR spectra, 2013; BioPhat.Explore, 2013).

2.5 Estudio de las propiedades antioxidantes

Las propiedades antiradicalar y antioxidante del aceite de P. pubinervulum fueron analizadas por diversos ensayos: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) espectrofotomético (Chen et al., 1999); DPPH en cromatografía de capa delgada de alta resolución (DPPH-(HP)TLC) (Rossi et al., 2011); (2,2’- azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic,acid) diammonium salt) (ABTS) espectrofotométrico (Scartezzini et al., 2006; Miller et al., 1996), y la Fotoquimioluminiscencia (PCL) (Popov y Lewin, 1996).

2.6 DPPH y ABTS espectrofotométrico

Para el ensayo DPPH se tomaron diversas cantidades del aceite de P. pubinervulum que fueron disueltas en dimetil sulfóxido (DMSO) hasta un volumen de 100 μl. A cada solución se le añadieron 2,9ml de 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH; 1 x 10- 4M en etanol), a esta solución se la agitó vigorosamente por 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.Las absorbancias fueron medidas a 517 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV mini 1240.

De forma similar se procedió con el test ABTS, acada solución disuelta en DMSO se añadió 0,9ml de(2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonic ácido)diamonio sal) 1 ×10−3M radicalizado previamentecon una solución de K2S2O87×10−2M. Lasabsorbancias fueron medidas a 734 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV mini 1240. La actividad antiradicalar para cada mezcla fue calculada de acuerdo con la siguiente fórmula:

donde Ab y Aa son las absorbancias del blanco y de las muestras respectivamente luego de 30 min (DPPH) y 1 minuto ABTS. La actividad anti radi- calar del aceite se evalúa con el cálculo del IC50, que equivale al 50% de la inhibición de la oxidación del DPPH y el ABTS, este se calculó de los datos de las curvas de calibración obtenidas de los datos de la concentración en función del porcentaje de inhibición. Como referentes de actividad se empleó el aceite esencial de T. vulgaris y el BHA (butilhidro-xianisol).

Los ensayos se hicieron por cuadruplicado para de esta manera calcular la desviación estándar en cada determinación de la capacidad inhibitoria al 50% (IC50).

2.7 Fotoquimioluminiscencia

La fotoquimioluminiscencia (Photochemiluminescence PCL) mide la capacidad antioxidante en sustancia puras o en mezclas complejas sea en fase lipófila (ACL) o hidrófila (ACW). Para la medida de la actividad antioxidante del aceite esencial de P. pubinervulum se utilizó la metodología (ACL) por ser la más aconsejable para trabajar con aceites esenciales (Ziosi et al., 2010), como control positivo de actividad se usó el aceite de Thymus vulgaris y Trolox como estándar de referencia.

Todos los análisis realizados tanto en el aceite en ensayo (P. pubinervulum), como en el patrón natural (aceite de T. vulgaris) y blanco positivo sintético BHA, fueron realizados por triplicado usando un análisis de varianza (ANOVA), empleando el programa STATISTICA 5.5. Un valor de probabilidad de p≤0.05 fue considerado como la significancia estadística.

2.8 Ensayo de actividad antiradicalar bioautográfica en cromatografía en capa delgada de alta resolución (DPPH- (HP)TLC)

La TLC bioautográfica es un ensayo de actividad antiradicalar que usa el radical DPPH para revelar la actividad separada de los compuestos en una mezcla compleja (Rossi et al., 2011).

Para la prueba fueron disueltos 30 µl de aceite de P. pubinervulum en 1 ml de metanol, se aplicaron directamente en una placa de sílica gel de alta resolución marca Merck 60, con indicador de fluorescencia F 254, las bandas fueron diseminadas con un espesor de 10 mm con la ayuda de un aplicador Linomat V (Camag). La fase móvil utilizada fue de tolueno/acetato de etilo/éter de petróleo (97/7/20).

En la placa desarrollada fue diseminada una solución metanólica de DPPH a una concentración de 0,5% (p/v), para determinar las fracciones activas y analizar su composición química con un análisis posterior de las moléculas en GC/EM.

2.9 Evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica

2.9.1 Evaluación de la mínima concentración inhibitoria MIC

Para la evaluación de la actividad antimicrobiana se siguió la metodología de difusión en disco descrita en varias investigaciones con aceites esenciales (Prabuseenivasan et al., 2006; Adam et al., 1998; Benkeblia, 2004). Fueron empleadas: Bacterias Gram+; Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 6538 y Streptococcus mutans ATCC 25175. Bacterias Gram-; Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Levaduras; Candida tropicalis ATCC 13803, Candida albicans ATCC 10231.

La actividad antimicrobiana se describe como la mínima concentración inhibitoria (MIC), en mg/ml, se usó como patrón natural de referencia aceite esencial de Thymus vulgaris.

La evaluación se realizó por triplicado, considerándose como valor de la mínima concentración inhibitoria a aquella que tenía dos coincidencias en tener un halo de inhibición superior a 1mm por fueradel disco estéril.

2.9.2 Ensayo de actividad antimicrobiana bioautográfica en cromatografía en capa delgada de alta resolución HP-TLC

Son varios los estudios que detallan la evaluación de la actividad antimicrobiana bioautográfica (Rossi et al., 2011; Purkayastha et al., 2012; Sadgrove et al., 2014), como una metodología útil en el estudio individualizado de las sustancias responsables de la actividad antimicrobiana.

Para el ensayo se desarrolló una placa HPTLC usando como solvente una mezcla de tolueno/acetato de etilo/éter de petróleo (97/7/20), los volúmenes de siembra del extracto fueron diversos (20, 15 y 10 µl) de una solución del aceite en metanol (30 mg/ml), realizados con la ayuda de un aplicador Linomat V (Camag). A la placa desarrollada se cubrió con un medio de cultivo que contenía una dilución de microorganismos; S. aureus (gram +) ATCC 6538 y E. coli (gram +) ATCC 8739. Además el medio contenía una solución de colorante TTC (2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride) para comprobar la vitalidad microbiana.

3 Resultados

3.1 Extracción del aceite esencial

El rendimiento promedio del aceite fue del 0,049 % p/p, la densidad del mismo fue de 0,9652g mL−1.

3.2 Composición química

En el aceite esencial fueron detectados 44 compuestos de los cuales fueron identificados 36 que equivalen al 94,249% (Tabla 1) y los compuestos más abundantes incluyen al -cariofileno, isoeugenol metil éter, asarona y el nerolidol (Figura 1). La mayoría de los componentes son sesquiterpenos oxigenados.

Tabla 1. Moléculas presentes en el aceite esencial de P. pubinervulum.





Tabla 2. IC50 para el aceite esencial de P. pubinervulum y T. vulgaris por los test DPPH y ABTS.


Tabla 3. Fotoquimioluminiscencia (PCL) del aceite esencial de P. pubinervulum en contraste con el aceite de Thymus vulgaris expresado como µmol de equivalentes de trolox por gramos de muestra.



Figura 1. Constituyentes más abundantes en el aceite esencial de P. pubinervulum.

El análisis RMN 1H hecho al aceite esencial evidenció la presencia de 3 compuestos que tuvieron los siguientes desplazamientos químicos en ppm:

de los cuales en literatura se tenían sus respectivos espectros, los cuales fueron usados para comparar las señales individuales de cada uno de ellos (Figura 2).

3.3 Evaluación de actividad antioxidante

3.3.1 DPPH and ABTS test

Para evaluar la actividad antiradicalar del aceite esencial se procedió a calcular su IC50 (concentración necesaria para inhibir el 50% de la oxidación), tanto para el método DPPH, como para el ABTS (Tabla 2). Como patrón de referencia natural se usó el aceite esencial de T. vulgaris y como compuesto de referencia el butil hidroxianisol (BHA).

3.3.2 PCL Test

Los resultados de la actividad antioxidante expresada como micro moles de trolox por gramo necesarios para inhibir la oxidación del luminol (Tabla 3).

En este test los resultados tienen una relacióndirecta es decir a mayor equivalencia μmol Troloxg−1, mayor es la actividad antioxidante, el valor de 1.2 μmol Trolox g−1, comparados con los 272 μmolTrolox g−1, dan a entender de una actividad antioxidante discreta en el aceite de P. pubinervulum.


Figura 2. Espectro RMN 1H del aceite esencial de P. pubinervulum. A: Señales del cariofileno, B: Señales del nerolidol, C: Señales de la asarona.

3.4 Actividad antiradicalar bioautográfica en cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC-DPPH)

La separación cromatográfica en capa fina evidencio la presencia de 5 bandas, 3 de las cuales decoloraron al revelador DPPH al 0,5% (p/v), y por ende manifiestan actividad antiradicalar, se pueden apre- ciar los resultados en la Tabla 4.

B.a: (HPTLC) del aceite esencial de P. pubinervulum; B.b: (HPTLC-DPPH) del aceite esencial de P. pubinervulum; B.c: (HPTLC-DPPH) del aceite esencial de T. vulgaris, control positivo. 1: Elemicina, (E)- nerolidol, asarona, dimetoxi 5 vinyl 1,2 benzodioxide 4-6, -bisabolol y geranil linalol. 2: Isoeugenol metil éter 3: -cariofileno, -humuleno, -selineno, biciclogermacreno, -bulseno, 7-epi- -selineno y -cadineno.

3.5 Evaluación de la mínima concentración inhibitoria MIC

Los resultados de la actividad antimicrobiana expresada como la mínima concentración inhibitoria MIC se describen en la Tabla 5. El resultado refleja la concentración mínima necesaria para inhibir el crecimiento de las bacterias y levaduras alrededor de un disco esteril mayor a 1 mm. Se considera un valor positivo si en al menos 2 de las 3 repeticiones la inhibición es la misma, en algunos casos la inhibición resultó ser igual a la del patrón natural de referencia el aceite esencial de Thymus.

3.6 Actividad antimicrobiana bioautográfica

Los resultados confirman actividad tanto para la bacteria Gram +, S. aureus, en este caso la actividad se denota en las fracciones de Rfs: 1 (Elemicina, (E)-nerolidol, -asarona, dimetoxi 5 vinil 1,2 ben-zodióxido 4-6, -bisabolol y geranil linalol) y 5 ( - cariofileno, -humuleno a, -selineno, bicicloger- macreno, -bulseno 7-epi- -selineno y -cadinene) Tabla 6; y en la bacteria Gram -, E. coli, para las fracciones de Rfs: 1, 2 (isoeugenol metil éter) y 5, evidenciables en la Tabla 7.

Tabla 4. (HPTLC-DPPH) bioautográfico del aceite esencial de P. pubinervulum.


Tabla 5. Actividad antibacteriana y antifúngica del aceite esencial de P. pubinervulum.


Tabla 6. HPTLC-autobiográfico antimicrobiano en S. aureus.


Tabla 7. HPTLC-autobiográfico antimicrobiano en E. coli.


4 Discusión

El presente estudio permitió revelar en un buen porcentaje la composición química del aceite esencial, para las moléculas más abundantes la confirmaciónse obtuvo por comparación del espectro RMN 1H.La actividad antioxidante no resultó ser muy elevada en comparación con el referente natural, debido seguramente a que ninguno de los componentes mayoritarios presentan estudios contundentes de tener una elevada actividad antioxidante comparablecon la del timol y el carvacrol presentes en T. vulgaris. Los resultados de mayor interés se relacionan con la evaluación de actividad antimicrobiana en donde se evidencian interesantes resultados en los respecta a las dos levaduras evaluadas C.tropicales y C. albicans, en este caso en la literatura científica es posible encontrar varios estudios que avalan una elevada actividad antifúngica en varios de los componentes mayoritarios como por ejemplo en el cariofileno (Sabulal et al., 2006), y en el nerolidol (Lee et al., 2007). De igual manera varios aceitesesenciales ricos en estos componentes han demostrado tener una buena actividad como es el caso de Bidens pilosa (Deba et al., 2008) y Eugenia disentérica (Costa et al., 2000) en aceites ricos en cariofileno y M. quinquenervia (Lee et al., 2008) caite rico en nerolidol. La especie P. pubinervulum podría constituirseen un recurso medicinal antifúngico que podría usarse de forma sostenible por las mismas comunidadesindígenas que habitan en la zona sur oriental del Ecuador y que por lo general sufren de carenciade insumos médicos.

5 Conclusión

El resultado de mayor relevancia se relaciona con la actividad antifúngica en las dos levaduras en estudio, es importante resaltar que ambas son responsables de muchas afecciones en la salud, y se podría plantear trabajos posteriores para evaluar dicha actividad en productos de aplicación tópica. Como conclusión final tenemos que con los estudios de composición química y actividad biológica hechas en el aceite esencial de P. pubinervulum, se contribuye a la valoración de esta planta medicinal de uso cotidiano en las comunidades indígenas de la amazonia ecuatoriana.

Agradecimientos

A la Universidad Politécnica Salesiana por el finan- ciamiento de la presente investigación.

Referencias

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Notas de autor

1 Universidad Politécnica Salesiana, Centro de Investigación y Valoración de la Biodiversidad, Av 12 de Octubre No 24-22 y Wilson, Teléfono: (593) 2 3962900, Quito, Ecuador.

1 Universidad Politécnica Salesiana, Centro de Investigación y Valoración de la Biodiversidad, Av 12 de Octubre No 24-22 y Wilson, Teléfono: (593) 2 3962900, Quito, Ecuador

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2 Università degli studi di Ferrara, Dipartimento di Scienze della Vita e Biotecnologie, Via L. Borsari 46, 44121, Ferrara, Italia.

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